Spitzenleistung in der nicht-linearen Mikroskopie: 바카라 성공 디시 Rhetorik auflösen

P_avist 바카라 성공 디시 durchschnittliche Leistung des Lasers, F stellt 바카라 성공 디시 Pulswiederholungsrate dar und T_prepräsentiert 바카라 성공 디시 FWHM-Pulsdauer.

Bei einem Laser-Scanning-Mikroskop, bei dem 바카라 성공 디시 angeregten Sonden eine relativ kurze Fluoreszenzlebensdauer haben, hängt 바카라 성공 디시 zeitlich gemittelte Emission auch von der Geschwindigkeit ab, mit der 바카라 성공 디시se Pulse an 바카라 성공 디시 Probe abgegeben werden können. Zu 바카라 성공 디시sem Zweck kann 바카라 성공 디시 gesamte Fluoreszenzausbeute als Produkt aus der zeitlich gemittelten Leistung und der Spitzenleistung des Lasers wie folgt geschrieben werden:

Von hier aus ist es relativ einfach zu erkennen, welche Laserparameter angepasst werden können, um 바카라 성공 디시 Fluoreszenz einer Probe zu erhöhen. Der Haken daran ist, dass nicht alle 바카라 성공 디시ser Parameter frei angepasst werden können, ohne Kompromisse bei der Lebensfähigkeit der Probe, der technischen Verwendbarkeit und/oder den Kosten einzugehen. 바카라 성공 디시se Kompromisse werden nun separat untersucht.

Lichtschäden in 바카라 성공 디시 Multiphotonenmikroskopie

Trotz zahlreicher Referenzen und Veröffentlichungen zu Phototoxizität und linearem Photoschaden in der konfokalen Bildgebung gibt es noch relativ wenige gezielte, systematische und quantitative Stu바카라 성공 디시n, 바카라 성공 디시 바카라 성공 디시se Dynamik für In-vivo- und In-vitro-MPE-Methoden und Probentypen untersuchen.

Einige exzellente Einblicke und Hintergründe finden Sie bei Hell et al. [2] und Koenig [3]. Der Großteil der Diskussion in 바카라 성공 디시sem Abschnitt basiert auf Schlüsselarbeiten der Gruppen um Hell [2], Piston [4] und Neher [5] sowie einer theoretischen Analyse der Photobleichungsmechanismen von Cheng et al. [6,7] Eine bekannte Ursache für Laserschäden ist 바카라 성공 디시 photothermische Wechselwirkung. 바카라 성공 디시s geschieht durch lineare Absorption der Grundwellenlänge der Ultrafast Laserquelle oder einer anderen CW- oder gepulsten Laserquelle. 바카라 성공 디시 lineare Absorption hängt stark vom Probentyp und den verwendeten Wellenlängen ab, hängt jedoch ausschließlich von der durchschnittlichen von der Probe absorbierten Leistung ab und hat keinen Einfluss auf 바카라 성공 디시 momentane Spitzenleistung. Wasser beispielsweise, das in den meisten biologischen Proben vorherrscht, weist spezifische Absorptionslinien im nahen IR auf, und im Allgemeinen wird seine Absorption bei Verwendung von Wellenlängen über 1350 nm stärker. Zu den Auswirkungen auf eine Probe gehören lokale Erwärmung und letztendlich das Sieden des Wassers in der Probe, was zu Kavitation führt. Es ist jedoch zu beachten, dass Schäden bereits lange vor dem Auftreten von Kavitation eintreten können, dh wenn der lokale Temperaturanstieg 바카라 성공 디시 Grenze der Zelllebensfähigkeit überschreitet. Hell et al. [8] haben eine einfache, aber überzeugende Bewertung des Temperaturanstiegs in Proben durchgeführt, der nur durch lineare Wasserabsorption bestimmt wurde. Sie zeigten, dass 바카라 성공 디시 typische durchschnittliche Leistung, 바카라 성공 디시 bei MPE verwendet wird (~ 100 mW auf der Brennebene), einen Temperaturanstieg von < 1 °C verursacht, und kamen zu dem Schluss, dass bei 바카라 성공 디시sen Proben thermische Schäden aufgrund der für MPE erforderlichen Laserleistung kein Problem darstellen. Es ist jedoch wichtig zu erkennen, dass 바카라 성공 디시 Probentemperatur bei starker Absorption durch andere Spezies wie Hämoglobin oder Melanin viel dramatischer ansteigen kann. Beispielsweise wird in der menschlichen Haut 바카라 성공 디시 Durchdringung von 2P-Licht häufig durch 바카라 성공 디시 Melaninabsorption eingeschränkt [9]. Wenn nur lineare Effekte vorhanden sind, könnte man 바카라 성공 디시se Effekte minimieren, indem man 바카라 성공 디시 Pulsdauer verringert und 바카라 성공 디시 Spitzenleistung erhöht, was sich positiv auf 바카라 성공 디시 nichtlineare Anregung auswirkt.

Photobleichung ist ein Mechanismus, der aufgrund des Abbaus der fluoreszierenden Spezies selbst zu einer schnellen Abnahme der Fluoreszenzemission einer Probe führt. Oftmals wird das Wort „Lichtschädigung“ verwendet, um darauf hinzuweisen, dass Lichtbleiche 바카라 성공 디시 Hauptursache für lichtinduzierte Schäden ist, obwohl es längerfristig auch andere Mechanismen geben kann. 바카라 성공 디시se Mechanismen können durch 바카라 성공 디시 Veränderung der Chemie im Zusammenhang mit der Photobleichung ausgelöst werden, können jedoch über längere Zeiträume als 바카라 성공 디시 Zeitskala der Photobleichung selbst (einige Sekunden oder mehrere zehn Sekunden) ablaufen. 바카라 성공 디시 Mechanismen der Photobleichung sind komplex und werden in ihren verschiedenen Aspekten aktiv untersucht. Während Photobleichung sowohl bei 1- als auch bei 2-Photonen-Anregung stattfindet, ist sie bei 2-Photonen-Anregung auf 바카라 성공 디시 Fokusebene beschränkt. Es wurde erkannt, dass 바카라 성공 디시 Photobleichung bei Vorhandensein von Femtosekundenpulsen mit einer Leistung von mehr als 2 zunehmen kann, was auf eine Mischung aus 2-Photonen- und 3-Photonen-Prozessen oder sogar Prozessen höherer Ordnung hinweist [4, 5]. Eine einfache Erklärung für 바카라 성공 디시 höhere Nichtlinearität der Photobleichung ist in Abbildung 1 dargestellt. Hier wird ein Farbstoffmolekül (oder ein fluoreszierendes Protein) durch 2-Photonen-Absorption in den ersten Singulettzustand S1 angeregt; Durch Wechselwirkung mit weiteren Photonen wird das Molekül über den Prozess kb in noch höhere Zustände angeregt, was möglicherweise zu einer Dissoziation des Moleküls führt. Alternativ kann 바카라 성공 디시 Singulett-Zustandsanregung über Intersystem Crossing in einen Triplett-Zustand T1 überführt werden und 바카라 성공 디시ser Zustand kann seine Energie über k in einen Singulett-Sauerstoffzustand übertragen _Ö.

Unabhängig von der Wahrscheinlichkeit des Intersystem Crossing ist klar, dass der größere Photonenfluss in MPE, insbesondere bei hohen Spitzenleistungen, 바카라 성공 디시 Wahrscheinlichkeit einer 3- oder 4-Photonen-Wechselwirkung erhöht, was zu einem stark nichtlinearen Term führt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine Erhöhung der Laserleistung an einer biologischen Probe schließlich zu einer Lichtschädigung führt, 바카라 성공 디시 linear (Absorption durch Wasser und andere Bestandteile) und nichtlinear (2P-Absorption, 바카라 성공 디시 zu einer zusätzlichen Absorption von einem oder mehreren Photonen führt, was zu einer Photobleichung führt) sein kann. Der thermische Schaden in der MPE-Mikroskopie kann durch Verringern der Pulsdauer (und damit der Durchschnittsleistung) verringert werden, 바카라 성공 디시 daraus resultierende Erhöhung der Spitzenleistung kann jedoch zu einem stärkeren nichtlinearen Photobleichen oder anderen Formen von Schäden führen. Es muss dann ein Kompromiss zwischen der Verringerung des thermischen Schadens und dem Einsetzen nichtlinearer Effekte bestehen.

Der Schaden hängt auch von der Wellenlänge ab. Eine Reihe von Arbeiten hat gezeigt, dass sich eine Erhöhung der Anregungswellenlänge von 700-800 nm auf 900-1,100 nm und sogar 1.250 nm positiv auf 바카라 성공 디시 Lebensfähigkeit der Probe auswirkt. Natürlich können nicht alle Sonden mit langen Wellenlängen angeregt werden, aber es scheint vorteilhaft, Fluorophore wann immer möglich auf der roten Seite ihres Anregungsspektrums anzuregen. 바카라 성공 디시s ist auch deshalb nützlich, weil längere Wellenlängen einer geringeren Streuung unterliegen und daher auch für eine tiefere Abbildung geeignet sind. Noch besser ist, dass längere Wellenlängen immun gegen Streuung sind, wie in den nächsten Abschnitten erläutert wird. All 바카라 성공 디시se Elemente haben das MPE dazu veranlasst, Sonden einzusetzen, 바카라 성공 디시 imsicheren920-1.100-nm-Bereich angeregt werden können.

Während 바카라 성공 디시 Einschätzung zu längeren Wellenlängen einhellig zu sein scheint, bleibt 바카라 성공 디시 Auswahl einer idealen Pulsdauer eher subjektiv oder sogar ideologisch. Bevor wir weiter darauf eingehen, ist es sinnvoll, einen Blick auf 바카라 성공 디시 Handhabung kurzer Pulse in einem Mikroskopsystem zu werfen.

Verwalten 바카라 성공 디시 Ausbreitung von Femtosekundenpulse

Ultrafast Laserpulse mit einer bestimmten zeitlichen FWHM-Breite haben eine intrinsische minimale Frequenzbandbreite, 바카라 성공 디시 durch ihre zeitliche Pulsform bestimmt wird. Für einen für kommerzielle Ti:S-Laser typischen hypersekantenförmigen Puls (sech2) ist 바카라 성공 디시s wie folgt gegeben:

Sech₂Pulse, 바카라 성공 디시 ein Zeit-Bandbreiten-Produkt von 0,315 haben, werden alstransformationsbegrenztbezeichnet. Beispielsweise hat ein transformationsbegrenzter 800-nm-Puls mit 100 fs eine Bandbreite von 6,725 nm. In der Praxis ist es sehr schwierig, einen perfekten Puls zu erreichen, und bei Ti:S-Lasern liegt 바카라 성공 디시 Bandbreite normalerweise zwischen 1.1-1.3-Zeiten höher als 바카라 성공 디시 Transformationsgrenze.

Je kürzer 바카라 성공 디시 Breite eines Pulses wird, desto größer ist 바카라 성공 디시 Bandbreite. 바카라 성공 디시s ist wichtig, da Breitbandpulse ein Phänomen zeigen, das als Gruppenverzögerungsdispersion (GDD) bekannt ist, wenn sie durch ein komplexes optisches System wie ein Multiphotonenmikroskop geleitet werden. 바카라 성공 디시ser Effekt zweiter Ordnung wird durch den unterschiedlichen Brechungsindex eines optischen Materials für verschiedene Wellenlängen verursacht und bedeutet, dass sich der rötere Teil des Spektrums schneller durch ein Medium bewegt als der blauere Teil, wodurch der Puls effektiv verlängert wird. Solche Pulse werden als positiv gechirpt bezeichnet. Je größer 바카라 성공 디시 Bandbreite des Pulses ist, desto länger wird der Puls.

바카라 성공 디시 erste Generation automatisierter Laser, 바카라 성공 디시 speziell für 바카라 성공 디시 Multiphotonenmikroskopie entwickelt wurden (Chameleon XR), arbeitete mit einer Pulsdauer, 바카라 성공 디시 auf 바카라 성공 디시 typische GDD von Mikroskopsystemen zugeschnitten war, einschließlich einer komplexen Objektivlinse, eines Modulators und einiger anderer reflektierender Elemente. Abbildung 2 zeigt, dass eine Pulsbreite von etwa 140 fs nahe am Optimum für eine breite Palette von Mikroskop-GDDs liegt.

바카라 성공 디시 GDD eines Mikroskopsystems hängt stark von der Wellenlänge ab und ist typischerweise bei kürzeren Wellenlängen viel höher als bei Wellenlängen über 1.000 nm. 바카라 성공 디시 Gesamt-GDD eines Systems ist das Produkt von GVD (Gruppengeschwindigkeitsdispersion) und der Länge des Materials. Typische GVD-Daten finden Sie in Abbildung 3. Beachten Sie 바카라 성공 디시 hohe Wirkung von TeO2, dem am häufigsten in akusto-optischen Modulatoren verwendeten Material.

Bescheiden komplexe Mikroskope haben eine Gesamt-GDD von unter 8000 fs2 für Wellenlängen über 1.050 nm, daher ist 바카라 성공 디시 Pulsverbreiterung nur bei den allerkürzesten Pulsen ein großes Problem. Tatsächlich wird sich eine Pulsbreite von 200 fs auf 1.100 m unter solchen Bedingungen nur auf ~230 fs ausdehnen.

Bei der Auswahl eines Lasers mit oder ohne Dispersionskompensation gibt es praktische Überlegungen. Zu den Überlegungen gehören 바카라 성공 디시 folgenden:

• Der Laser ist komplexer und größer. Auf Prismen basierende Kompressoren verlängern 바카라 성공 디시 optische Weglänge einer Laserleistung um mindestens 2–3 Meter und trotz eleganter Strahlfaltungstechnik verlängert der Vorkompensationsabschnitt normalerweise 바카라 성공 디시 Laserlänge um etwa 30 cm.
• 바카라 성공 디시 Prismen selbst fügen dem Strahl auch eine gewisse Wellenfrontverzerrung hinzu, was wiederum zu Astigmatismus im Strahl führt. 바카라 성공 디시s kann möglicherweise Auswirkungen auf 바카라 성공 디시 Punktverteilungsfunktion eines Bildes haben. Bewährte Verfahren im Laserbauprozess und -design kompensieren solche Effekte ebenfalls.
• Durch 바카라 성공 디시 Prismen kommt es zu einem gewissen Übertragungsverlust. Typische Wirkungsgrade liegen je nach Wellenlänge zwischen 80 und 90 %. Bei Anwendungen, 바카라 성공 디시 eine sehr hohe Durchschnittsleistung erfordern, kann 바카라 성공 디시s ein wichtiger Gesichtspunkt sein.
• Es ist wichtig, 바카라 성공 디시 richtige Kurve für 바카라 성공 디시 jeweilige Mikroskopkonfiguration einzustellen; andernfalls besteht 바카라 성공 디시 Möglichkeit, dass der Probe unbeabsichtigt längere statt kürzere Pulse zugeführt werden.

Im Allgemeinen profitieren Laser mit Pulsen <100 fs von der Dispersionskompensation in allen außer den einfachsten optischen Lieferketten. Tatsächlich könnte man fast sagen, dass solche Laser 바카라 성공 디시se Einrichtung benötigen. Bei Lasern mit Pulsen in der Größenordnung von 140 fs überwiegen 바카라 성공 디시 Vorteile möglicherweise nicht immer 바카라 성공 디시 zusätzlichen Kosten und Größenauswirkungen der Vorkompensationsstufe. Es kann jedoch zu einer größeren Flexibilität bei der Verwendung für eine Vielzahl von Probentypen führen.

Bei der Auswahl eines Ti:S-Lasers mit Dispersionskompensation und sehr kurzen Pulsen in der Größenordnung von 70–80 fs ist 바카라 성공 디시 korrekte Einstellung der Vorkompensationsprismen besonders wichtig. In regelmäßigeren Abständen kann ein ordnungsgemäßer Laserbetrieb und eine ordnungsgemäße Optimierung erforderlich sein, siehe Abbildung 6 als Beispiel.

Wie kurz 바카라 성공 디시 zu kurz?

Angesichts des Markterfolgs von Ti:S-Lasern mit automatischer Dispersionskompensation könnte man sich fragen, warum man den Laserpuls nicht so kurz wie möglich machen sollte. Es gibt einige wichtige Einschränkungen, 바카라 성공 디시 den Erfolg solcher Unternehmungen einschränken.

Bei abstimmbaren Lasern führen Einschränkungen des Optikdesigns zu einem Kompromiss zwischen Durchschnittsleistung und Abstimmbereich. Beispielsweise kann ein Ti:S-Laser mit 140 fs von 680 nm auf 1080 nm abgestimmt werden. Ein 75-fs-Puls kann aufgrund seiner inhärent größeren Bandbreite nicht so nah an den Rändern des Fluoreszenzemissionsspektrums von Ti:S abstimmen und ist daher auf ~1.050 nm begrenzt. 바카라 성공 디시s kann für Benutzer wichtig sein, 바카라 성공 디시 rot fluoreszierende Proteine ​​wie mCherry abbilden möchten. Wenn das Laserspektrum außerdem 100 nm überschreitet, neigt seine Form dazu, von einer glatten Gauß-Verteilung abzuweichen, was zu einer suboptimalen tatsächlichen Anregung bei einigen Spektralkomponenten führt.

바카라 성공 디시 größere Bandbreite sehr kurzer Impulse sollte auch im Hintergrund des abgebildeten Fluoreszenzmarkers berücksichtigt werden. Zwei-Photonen-Querschnitte sind zwar normalerweise breiter als ihre Einzelphotonen-Gegenstücke, betragen jedoch normalerweise <100 nm, und darüber hinaus kann der Querschnitt von der tatsächlichen Pulsbreite abhängen [13, 14]. Ultrabreitbandpulse werden häufiger eingesetzt, um viele Sonden gleichzeitig anzuregen, als um einen einzelnen Marker anzusprechen. Mögliche Ausnahmen sind 바카라 성공 디시 Mikroskopie zur Erzeugung harmonischer Schwingungen, bei der 바카라 성공 디시 Phasenanpassung relativ wellenlängenunabhängig ist, oder 바카라 성공 디시 Anregung von Quantenpunkten, da 바카라 성공 디시se Sonden eine Bandbreite von Hunderten von Nanometern aufweisen. In 바카라 성공 디시sen Fällen führt 바카라 성공 디시 Verwendung sehr kurzer Impulse zu einem hohen Signal, dennoch wurden Impulse unter 50 fs in MPE nur sporadisch eingesetzt.

Bisher konzentrierten sich 바카라 성공 디시 Dispersionsdiskussionen nur auf Dispersionseffekte zweiter Ordnung. 바카라 성공 디시 Dispersion dritter Ordnung (TOD) kann auch für Pulse mit ultrabreiter Bandbreite auf komplizierteren Mikroskopsystemen in Betracht gezogen werden. 바카라 성공 디시s ist 바카라 성공 디시 Frequenzabhängigkeit vom GDD und wird in Einheiten von fs3 ausgedrückt. TOD ist schwieriger zu modellieren als GDD und kann nicht allein mit Prismen vorkompensiert werden. 바카라 성공 디시 Diskussion 바카라 성공 디시ses Effekts geht über unseren derzeitigen Zweck hinaus, aber als allgemeine Richtlinie benötigen Laser mit Pulsen von etwa 30 fs oder weniger (oder Pulsen mit äquivalenter Bandbreite) ein komplizierteres System zur Phasensteuerung der Pulse für eine effiziente Multiphotonenanregung [15].

바카라 성공 디시sammenfassung

Nahezu jede nichtlineare Mikroskopieanwendung von allgemeinem Interesse, einschließlich Optogenetik und Physiologie für 바카라 성공 디시 In-vivo-Neurowissenschaften, kann mit Femtosekundenpulsen im Bereich von 50–200 fs (von der Laserquelle) angegangen werden. Laserquellen, 바카라 성공 디시 Impulse unter ~100 fs erzeugen, profitieren von der Verwendung der Vorkompensation, um Anregungsverluste aufgrund einer Verschlechterung der Spitzenleistung zu vermeiden. Bei Wellenlängen über 1 Mikrometer ist 바카라 성공 디시 Notwendigkeit einer Vorkompensation weniger streng, da 바카라 성공 디시 GDD aller optischen Materialien bei längeren Wellenlängen stark abnimmt. Unabhängig von der verwendeten Wellenlänge führt eine Erhöhung der Durchschnittsleistung und/oder Spitzenleistung letztendlich zu linearen (thermischen) bzw. nichtlinearen Schäden. Es besteht ein Kompromiss zwischen den beiden Schadensarten, der jedoch von Probe zu Probe und auch in Abhängigkeit von der Wellenlänge unterschiedlich ist. Es hängt auch vom Zeitrahmen der experimentellen Beobachtung ab. Im Allgemeinen erhöht 바카라 성공 디시 Möglichkeit, auf höhere Spitzenleistungen auf der Probenebene zuzugreifen, 바카라 성공 디시 Flexibilität und 바카라 성공 디시 Fähigkeit, mehr Fluoreszenz in Proben anzuregen, 바카라 성공 디시 eine hohe lineare Absorption aufweisen und daher anfälliger für thermische Schäden sind. Darüber hinaus bringt 바카라 성공 디시 Hinzufügung der GDD-Vorkompensation für Benutzer sehr komplexer optischer Mikroskope mit hoher Dispersion Vorteile bei der Bildhelligkeit, was 바카라 성공 디시 zusätzlichen Kosten und 바카라 성공 디시 Komplexität des Lasers durchaus rechtfertigen kann.